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Diagnóstico do Metapneumovirus aviário - Determinação do antígeno

Os seguintes métodos podem ser utilizados para a identificação do vírus

• Isolamento viral
• Prova de imunofluorescência
• Prova de imunohistoquímica
• Microscopia eletrônica
• RT-PCR e RFLP

O diagnóstico laboratorial também pode ser feito utilizando a sorologia determinando a presença de anticorpos.

Isolamento viral

O isolamento viral deve ser realizado ao aparecimento dos primeiros sinais clínicos da doença, uma vez que o MPV se apresenta tanto em perus como em frangos/galinhas por um período de tempo muito curto após a infecção.

A utilização de aves sentinelas ou a passagem do material coletado em aves SPF pode ser de grande ajuda neste aspecto.

O isolamento viral pode ser feito em:

• Ovos embrionados livres de patógenos específicos (SPF) inoculados no saco vitelínico.
• Cultivo de anéis traqueais
• Diferentes cultivos celulares (por exemplo, de fibroblastos de embrião de galinha).  O isolamento dos subtipos A e B e de material de campo não pode ser feito em cultivos celulares, para isso devem ser utilizados anéis de traquéia ou a inoculação de ovos embrionados no saco vitelino.  Nos Estados Unidos, é reportado o uso de cultivos celulares para o isolamento do subtipo C, mas usualmente com o material de campo são feitos pelo menos duas passagens no saco vitelínico antes de ser passado aos diferentes tipos de cultivos celulares.

O vírus causa hemorragias nos embriões e em alguns mortalidade; os fluídos do ovo podem ser inoculados nos cultivos celulares (VERO, FEG) nos quais será observado o efeito citopático, usualmente após várias passagens cegas.  Uma vez isolado o vírus, este pode ser adaptado a uma variedade de cultivos celulares (por exemplo, VERO, FEG etc).  Quando se trabalha com cultivos de anéis traqueais deve ser lembrado que o subtipo C não é ciliostático e, portanto, não é possível utilizar este método para o isolamento desse subtipo de material de campo.

Gráfico 1: O MPV pode ser isolado por um período curto após a infecção.  Quando os lotes apresentam sinais clínicos da infecção, o vírus já não pode ser isolado.

[imagem não exibida no email]

Cook, J. K. A. (2000). Avian rhinotracheitis. In: Revue Scientifique et Technique, Office International des Epizooties, 19, pp 602-613.

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Prova de imunofluorescência

Conjugado de anticorpos e fluoresceína, ao qual o MPV é observado nos anéis traqueais, caso em que o vírus esteja presente.  O método de coloração conhecido como imunohistoquímica permite o reconhecimento do vírus nos diferentes tecidos e órgãos.

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Imunohistoquímica

Método de coloração que permite o reconhecimento do vírus nos órgãos

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Microscopia eletrônica

Reconhece a morfologia viral

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RT-PCR e RFLP

O RT-PCR (do inglês: reverse transcriptase - polymerase chain reaction = reação em cadeia pela polimerase transcrição reversa) e o RFLP (do inglês: Restrictive fragment length polymerase = análise do polimorfismo na longitude dos fragmentos de restrição), são utilizados com freqüência para detectar e diferenciar entre cepas virais.  A técnica baseia-se na determinação e a comparação dos fragmentos de nucleotídeos de certos genes do vírus.  Os “primers” são selecionados de maneira que sejam reconhecidos todos os tipos do vírus ou especificamente os diferentes tipos.  Os resultados são obtidos rapidamente, mas é importante lembrar que a sensibilidade do procedimento e a durabilidade do DNA podem resultar em contaminações de PCRs prévios que foram feitos no mesmo laboratório e que podem ser necessários RT-PCR subtipo-específicos para detectar a presença de todos os subtipos existentes do vírus.

Esta tecnologia também pode ser utilizada para avaliar a presença dos diferentes subtipos de MPV no campo.

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